Epha4敲除大鼠模型
討論與結(jié)論
Epha4是最近發(fā)現(xiàn)的肌萎縮側(cè)索硬化（漸凍癥，ALS）的致病基因，目前關(guān)于Epha4的研究主要集中在其神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育階段中所扮演的角色。然而，Epha4在不同組織器官中均廣泛表達(dá)，而關(guān)于Epha4在其他組織中的作用卻鮮有報道。
目前Epha4基因敲除動物模型多為小鼠。研究報道基因敲除的小鼠具有共濟失調(diào)、袋鼠步態(tài)等表型。而我們建立的Epha4基因敲除大鼠除觀察到以上表型外，還發(fā)現(xiàn)其生存率下降。且該模型因為在Epha4基因的啟動子后插入了報告基因mCherry，可以觀察到Epha4基因在不同組織器官的表達(dá)模式。該模型大鼠為探究Epha4在各組織器官中的病理生理作用提供了實驗條件。
由于觀察到Epha4基因在心臟中的差異性表達(dá)——在心臟中的分布主要集中在心房部位，所以我們推測Epha4基因?qū)π姆康慕Y(jié)構(gòu)功能產(chǎn)生影響。我們進(jìn)一步檢測了心臟功能，并發(fā)現(xiàn)心臟功能，尤其是心房功能出現(xiàn)明顯改變。我們觀察到Epha4基因敲除大鼠心房明顯擴大，心房射血分?jǐn)?shù)顯著下降，且心電出現(xiàn)明顯異常。所以Epha4可能對心房發(fā)育過程產(chǎn)生影響。因此，本基因敲除大鼠模型也可作為研究心房發(fā)育或心電異常的動物模型，為探究Epha4在心房發(fā)育及心電傳導(dǎo)中的作用提供實驗條件。
生物安全性
SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18003.
評價驗證
4.1 Epha4敲除大鼠模型的建立
通過PCR方法進(jìn)行基因型鑒定Epha4敲除大鼠基因型。免疫印跡Westernblot方法鑒定Epha4-/-大鼠epha4蛋白的敲除（圖2）。
圖2 Epha4敲除大鼠模型基因型鑒定及基因蛋白表達(dá)水平鑒定
4.2 Epha4敲除大鼠生存率分析
對Epha4-/-基因型和WT野生型進(jìn)行生存率分析顯示，WT生存正常，生存率為100%，Epha4-/-生存率下降（圖3）。
圖3 Epha4敲除大鼠生存率分析
4.3 Epha4敲除大鼠心臟重量/體重比分析
對WT和Epha4-/-進(jìn)行大體形態(tài)觀察并計算心臟重量與體重之比（heart weight/body weight，HW/BW）。實驗結(jié)果，與野生型相比，2、6、9月齡Epha4-/-大鼠心臟/體重比均無明顯變化（圖4）。2M WT大鼠HW/BW平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為0.38 ± 0.035（%），KO大鼠0.393 ± 0.052（%）；6M WT大鼠HW/BW平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為0.352 ± 0.024（%），KO大鼠0.0.369 ± 0.035（%）；9M WT大鼠HW/BW平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為0.311 ± 0.043（%），KO大鼠0.338± 0.047（%）。從形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，Epha-/-大鼠的心房與野生大鼠相比明顯增大，計算心房重量與心臟重量比值（atrium weight/body weight,AW/HW）。實驗結(jié)果顯示，與WT相比，Epha4-/-右心房/心臟重量比顯著增加，2M WT大鼠右心房AW/HW平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為5.939 ± 1.192（%），KO大鼠為7.112 ± 1.283（%）；6M WT大鼠右心房AW/HW平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為4.655 ± 0.541（%），KO大鼠為6.892 ± 0.857（%），有顯著性差異（圖5，*P<0.05）；9M WT大鼠右心房AW/HW平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為4.72± 0.936（%），KO大鼠為7.478± 0.681（%），差異非常顯著（圖5，**P<0.01）。圖 4 Epha4敲除大鼠HW/BW比率分析
圖 5 Epha4敲除大鼠AW/HW比率分析
4.4 M型超聲心動圖檢測Epha4敲除大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能
為分析心臟結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)改變，本研究通過M型超聲心動圖檢測1、2、6、9四個月齡野生和敲除大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能。發(fā)現(xiàn)與同窩WT大鼠相比，自2M起，Epha4-/-大鼠射血分?jǐn)?shù)明顯下降，差異顯著（圖6，*P<0.05，**P<0.01），而左心室內(nèi)徑、室壁均無明顯變化（圖6）。
圖6 Epha4敲除大鼠左心室結(jié)構(gòu)功能分析
注：射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）；舒張期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; diastolic，LVAW;d）；左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVID;d）；、。*P<0.05，**P<0.01，versus同窩WT大鼠。
4.5磁共振成像分析Epha4敲除大鼠心房結(jié)構(gòu)和功能
為進(jìn)一步分析Epha4敲除大鼠心房的結(jié)構(gòu)和功能，本研究通過核磁分析2、6、9月齡WT和Epha4敲除大鼠左右心房容積和射血分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，與WT大鼠相比，Epha4敲除大鼠左右心房容積均無明顯變化。但6、9月齡敲除大鼠心房射血分?jǐn)?shù)與野生大鼠相比明顯下降，6M組WT左房射血分?jǐn)?shù)為69.763±9.918（%），KO左房射血分?jǐn)?shù)為47.35±7.458（%）；WT右房射血分?jǐn)?shù)為69.123±14.592（%），KO右房射血分?jǐn)?shù)為39.67±7.653（%）。9M組WT左房射血分?jǐn)?shù)為52.738±10.739（%），KO左房射血分?jǐn)?shù)為46.637±4.487（%）；WT右房射血分?jǐn)?shù)為56.978±14.281（%），KO右房射血分?jǐn)?shù)為32.967±2.492（%）（圖7）。
圖 7 Epha4敲除大鼠左右心房結(jié)構(gòu)功能分析
4.6心電分析Epha4敲除大鼠心傳導(dǎo)功能
從上面的結(jié)果我們已知，心房的改變發(fā)生在心室改變之前，為了進(jìn)一步分析心房的電傳導(dǎo)功能，我們對WT和Epha4敲除大鼠進(jìn)行了心電圖記錄。結(jié)果顯示，自1M起，敲除大鼠的心電出現(xiàn)了明顯的改變，p波消失（圖8），QRS波峰值增高，QT間期延長（圖9，**P<0.01）。
圖 8 Epha4敲除大鼠心電圖記錄
圖 9 Epha4敲除大鼠心電指標(biāo)分析
制備方法
3.1 實驗材料
3.1.1 實驗動物
SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18003.
3.1.2實驗儀器
3.1.3實驗試劑
3.1.4 模型構(gòu)建流程在Epha4基因的啟動子后插入一個報告基因mCherry，造成移碼突變，實現(xiàn)基因敲除，制備Epha4基因敲除大鼠，并使用PCR方法進(jìn)行基因型鑒定，使用Western blot技術(shù)進(jìn)行敲除效率的鑒定。3.1.5 Epha4敲除大鼠的建立3.1.5. 1 Epha4敲除大鼠模型的建立(1) 設(shè)計方案
(2) 構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expressionvector，根據(jù)基因信息選擇靶點并合成sgRNA。
靶點1:
CCA GCCTCCGGAGACCTTGAG
R-EPHA4-gRNAUP1 5’TAGGCTCAAGGTCTCCGGAGGC
R-EPHA4-gRNADOWN1 5’AAACGCCTCCGGAGACCTTGAG
靶點2:
CCC GGCGAATGAAGGTAAGAG
R-EPHA4-gRNAUP2 5’TAGGCTCTTACCTTCATTCGCC
R-EPHA4-gRNADOWN2 5’AAACGGCGAATGAAGGTAAGAG
(3) 合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。
(4) 構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。
(5) 顯微注射
1) 超數(shù)排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進(jìn)行超排。
2) 受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。
3) 雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的SD雄鼠。
4) 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
5) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。
(6) 基因型鑒定
1) 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號及取材。
2) 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA
3) PCR檢測：根據(jù)序列信息設(shè)計檢測引物并進(jìn)行PCR檢測。
(7) 結(jié)果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
(8) 根據(jù)測序結(jié)果確定Epha4敲除模型大鼠（SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續(xù)實驗。
3.1.5.2 Epha4敲除大鼠的建立
根據(jù)3.1.5.1獲得Epha4-/-大鼠F1代后，首先通過8周齡左右Epha4-/-與野生型大鼠進(jìn)行雜交，獲得一定數(shù)量的Epha4+/-大鼠。之后使8周齡左右Epha4+/-大鼠進(jìn)行第二輪雜交，可得到Epha4-/-大鼠，用于后續(xù)實驗。
3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取
在幼崽出生后剪腳趾標(biāo)記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒說明書按以下程序操作。
(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。
(2) 12000rpm 離心5min，轉(zhuǎn)移上清于一無菌的離心管中。
(3) 加入500μLBB2，立即渦旋5s，室溫孵育10min。
(4) 將全部的溶液加入離心柱中，8000rpm離心1min，棄掉流出液。
(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm離心1min，棄掉流出液。
(6) 重復(fù)步驟（5）一次。
(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000rpm 離心1min，棄掉流出液。
(8) 重復(fù)步驟（7）一次。
(9) 10000rpm 離心2min，徹底去除殘留的WB2。
(10) 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5min，在柱的中央加入50~200μL預(yù)熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3min，12000rpm 離心2min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。
研究背景
一、疾病概述
心律失常（arrhythmia）是由于竇房結(jié)激動異常或激動產(chǎn)生于竇房結(jié)以外，激動的傳導(dǎo)緩慢、阻滯或經(jīng)異常通道傳導(dǎo)，即心臟活動的起源和（或）傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致心臟搏動的頻率和（或）節(jié)律異常。心律失常是心血管疾病中重要的一組疾病。它可單獨發(fā)病，亦可與其他心血管病伴發(fā)。其預(yù)后與心律失常的病因、誘因、演變趨勢、是否導(dǎo)致嚴(yán)重血流動力障礙有關(guān)，可突然發(fā)作而致猝死，亦可持續(xù)累及心臟而致其衰竭。
遺傳性心律失常多為基因通道突變所致，如長QT綜合征、短QT綜合征、Brugada綜合征等。后天獲得性心律失常可見于各種器質(zhì)性心臟病，其中以冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌病、心肌炎和風(fēng)濕性心臟病多見，尤其在發(fā)生心力衰竭或急性心肌梗死時。另有發(fā)生在基本健康者或植物神經(jīng)功能失調(diào)患者中的心律失常。其他病因包括電解質(zhì)或內(nèi)分泌失調(diào)，麻醉，低溫，胸腔或心臟手術(shù)，藥物作用和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，部分病因不明。
二、模型背景
1、造模因素信息
Epha4，Ephreceptor A4 [Rattus norvegicus]，Gene ID：316539。
2、實驗動物背景信息
SD大鼠
3、研究背景
受體酪氨酸激酶（receptortyrosine kinases, RTKs）可使外界刺激信息傳遞至細(xì)胞核，參與細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)化及胚胎發(fā)育等重要生理過程。Eph家族(包括Eph受體和ephrin配體)是最大的RTK亞族。Eph受體是一種膜結(jié)合的Ⅰ型糖蛋白,其結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)及跨膜區(qū)，其胞外區(qū)包括一個IgG樣球形結(jié)構(gòu)域。作為一大類新發(fā)現(xiàn)的RTK，Eph家族廣泛的種屬和組織分布，結(jié)構(gòu)上的高度保守，提示它們在細(xì)胞內(nèi)具有重要的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，Eph家族不僅在胚胎神經(jīng)、脈管系統(tǒng)的發(fā)育和分化中發(fā)揮作用，而且參與不同組織和細(xì)胞間多條通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫功能的調(diào)節(jié)；另外，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程也密切相關(guān)1,2。有關(guān)Eph的研究尚處于資料和認(rèn)識的積累階段；克隆Eph亞族新基因，繼續(xù)探索各成員的天然配體、特異底物范圍及生理功能仍然是目前研究的熱點。
根據(jù)基因結(jié)構(gòu)、堿基序列同源性、表達(dá)分布及結(jié)合配體的不同，Eph受體被分為EphA（A1-A8，A10）和EphB（B1-B4，B6）兩個亞家族，其相應(yīng)配體被命名為ephrin，根據(jù)結(jié)合方式也分為Ａ、Ｂ兩類ephrinA（A1-A5）與ephrinB（B1-B3）3,4。一般認(rèn)為EphA的配體是ephrinA，EphB的配體是ephrinB，但是研究發(fā)現(xiàn)Epha4既可以結(jié)合ephrinA也可結(jié)合ephrinB5。
Epha4與配體結(jié)合后，可以激活其下游NCK、RAS、Src、PDZ等信號，參與細(xì)胞生長、運動、凋亡及癌變等重要生理病理過程6-9。目前關(guān)于Epha4的研究主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。在發(fā)育早期，Epha4在中樞神經(jīng)的發(fā)育過程中高表達(dá)，與菱腦發(fā)育和形態(tài)形成關(guān)系密切；在成年階段，Epha4被證實與突觸可塑性和興奮毒性有關(guān)，同時它還是肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophiclateral sclerosis，ALS）的重要修飾基因3,10, 11。然而，Epha4的表達(dá)不僅限于神經(jīng)系統(tǒng)；根據(jù)表達(dá)譜，在人體多種組織中，Epha4均有不同程度表達(dá)。最新研究表明，Epha4與多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺導(dǎo)管癌等多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等過程有關(guān)12-19；另外，Epha4還參與胰高血糖素分泌、破骨細(xì)胞活性調(diào)控、單核細(xì)胞在血管上皮粘附、先天性腎盂積水以及胸腺發(fā)育等生理或病理過程20-23（表1），預(yù)示著Epha4在非神經(jīng)組織中也應(yīng)具有重要作用。
目前的研究多采用基因敲除小鼠作為Epha4基因功能研究的動物模型。研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常、跳躍的“袋鼠式”步態(tài)，同時還出現(xiàn)腎組織損傷、胸腺發(fā)育異常等20,21, 24, 25。但關(guān)于Epha4對其他非神經(jīng)組織的影響未見報道。
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模型信息
中文名稱:Epha4敲除大鼠模型
英文名稱:SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS
類型:心律失常動物模型
分級:NA
用途:本基因敲除大鼠模型也可作為研究心房發(fā)育或心電異常的動物模型，為探究Epha4在心房發(fā)育及心電傳導(dǎo)中的作用提供實驗條件。
研制單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所
保存單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所
